El primer paso de la práctica es bastante obvio: comprar el queso. Decidimos comprar 3 quesos supuestamente puros, uno de vaca, uno de oveja, uno de cabra. Además, compramos 4 tipos de mezclas diferentes, cuya proporción de leche conocemos. Tenemos, por lo tanto, nuestros 7 quesos que serán objeto de estudio.



Tenemos nuestros quesos en 7 tubos falcon. El primer paso tiene que ser poder extraer las proteínas de este queso, librándonos del resto de material indeseado. Queremos la fracción sérica. El proceso de obtención de proteínas en una mezcla se llama [url="http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm"] precipitación protéica [/url], y se basa en desnaturalizar la estructura de la proteína para que ya no sea soluble y se haga "una bola" que podamos distinguir.

Una manera de precipitar es desnaturalizar la proteína según el pH. El pH es la concentración de protones en una disolución acuosa; y subiéndolo/bajándolo las proteínas se desnaturalizan. Cada proteína se desnaturaliza en un pH diferente. A pH 4.6, según marca la bibliografía, conseguimos precipitar las proteínas caseinas de la leche, quedándonos solubles las proteínas del lactosuero, que podemos analizar. Podemos conseguir un tampón (una disolución que mantiene el pH estable) a 4.6 si mezclamos ácido acético y acetato de sodio a cantidades medidas y calculadas previamente.
Así mismo, no voy a poner ningún cálculo ni cantidades cada reactivo que utilizamos. Los puedo explicar si alguien tiene mucho interés, pero sino haría el post (aún) más denso.



Mezclando esta disolución con el queso y triturando obtenemos algo interesante.




Conseguimos en todos los tubos una triple banda. La banda amarilla central es la zona protéica que queremos analizar. Ambas bandas blancas que la rodean son restos de otras proteínas o grasa del queso que no nos interesa.

Extraemos la banda amarilla (proteínas del lactosuero) con una micropipeta y lo pasamos a un tubo eppendorf. Añadimos en este tubo la misma cantidad de glicerol. El glicerol es una sustancia que hará que sea más densa la mezcla, haciendo que "caiga" más rápido. Echamos, además, un poco de azul de bromofenol, diluído 1000 veces. El azul de bromofenol es un colorante (de color azul, correcto) que nos permitirá ver el avance en el proceso de la electroforesis.



El resultado final son 7 tubos eppendorf (1 para cada queso) con sus proteínas del lactosuero más densas y teñidas de azul. Como teníamos suficiente material, decidimos hacer 2 tubos para cada queso, quedando un total de 14 tubos eppendorf de este aspecto cada uno.



La preparación de la muestra ya está. Estos 14 tubos serán los que analizaremos.

Llegados a este punto, toca realizar de verdad la separación. Utilizaremos el método de la electroforesis. La electroforesis es un proceso de separación de una mezcla de diferentes sustancias, en función de cuán rápido se muevan bajo la acción de la electricidad. Es un proceso un poco tedioso pero para simplificar bastará con esta idea: una molécula (una proteína en nuestro caso) se moverá más cuanto más carga tenga y también cuanto menos pese (es bastante lógico). Es decir, separa en función de la carga y de la masa: relación masa/carga. Hay otras modalidades electroforéticas que separan en función de la masa solamente, o en función de la carga. Si hacemos que estas proteínas pasen por un gel que sea muy pequeño y no permita el paso a las proteínas más grandes, podemos diferenciarlas también en función del tamaño que tengan.

Como sabemos la relación masa/carga de las proteínas de vaca, cabra y oveja, podemos separarlas.
Simplificando, tenemos que montar un dispositivo (de alguna manera que no sabemos cómo) con algún tampón (que no sabemos de qué pH ni cómo prepararlo) para que se separen las proteínas (y no sabremos identificarlas posteriormente) después de realizar la electroforesis (que no sabemos a qué voltaje poner la electricidad).

Con la bibliografía respondemos a la mayoría de las preguntas. Hay algunas que no podemos saber de ninguna manera: nos vemos obligados a hacer ensayo-error. Es decir, hacerlo como creemos que está bien y... rezar para que salga algo. Si no sale, habrá que repetirlo todo, sabiendo que nuestro primer método era erróneo.

Empezaré por el final para explicar el manejo experimental. Esto es lo que tenemos que llegar a conseguir:



El dispositivo está formado por un cristal que tiene dos huecos, arriba y abajo, para introducir líquido (una disolución tampón). Así mismo, en el medio, tiene sitio para meter de manera vertical "un sandwich" de dos cristales. Dichos cristales se sujetan al cristal de soporte con pinzas. Dentro de estos dos cristales está el gel que hemos preparado y al cual le introducimos la muestra. El soporte tiene dos salidas para aplicarle campo eléctrico.



Los cristales son esto.



Sé que en la foto no se ve bien. pero hay un cristal en la mesa, en el medio el gel, y encima otro cristal. Instrumentalmente es algo complicado. Básicamente echamos en medio de los cristales una mezcla de tampón 8.9 pH, agua, persulfato amónico, TEMED y una mezcla de acrilamida/biscarilamida (son moléculas que se ensanchan, haciendo que no todas las moléculas sean capaces de pasar por el gel) con cantidades medidas. Después sellamos el gel por los lados para que no se escape nada.



Dejamos que se enfríe, lo ponemos pegado en el soporte, y con una micropipeta introducimos la muestra en los pocillos que tiene el gel.



Al final, queda algo así. (Lo de arriba son fuentes de alimentación, a 300 y 250 V, que proporcionan la electricidad):



Dándole tiempo (¿Cuánto tiempo? Es otra de las preguntas más importantes que teníamos que resolver) y gracias a la aplicación del campo eléctrico, tendremos algo así.



El azul de bromofenol que le echamos al queso ha bajado por ser más denso. Esto se llama el frente de la disolución. Por arriba, en la zona que no se ve nada, están las proteínas, supuestamente separadas.

Para verlas, se realiza un proceso doble de tinción y desteñido, utilizando un colorante especial, azul de Coomassie, que tiñe a las proteínas. Después de teñirlas, podremos verlas separadas.



Sólo nos queda ver los resultados e interpretarlos.

Espero que este post haya cumplido su función, que no es más que enseñar la dificultad que puede tener un proyecto científico empezando desde 0; ejemplificado en este simple análisis de quesos. Así mismo, espero que haya sido ameno de leer. Estaré encantado de contestar alguna posible pregunta.